美国Brimrose公司 AOTF-近红外光谱技术建立心通口服液快速分析方法

以 AOTF-近红外光谱技术建立心通口服液快速分析方法

[摘要]： 目的：应用声光可调滤光器（AOTF）-近红外光谱技术和化学计量学方法建立一种 用于心通口服液快速定性、定量分析的新方法。方法：采用 PCA 主成分分析和偏最小二乘法 分别进行定性定量分析。结果：建立的 XT-C 定性分析模型可正确判断心通口服液；建立的 定量模型准确性好，葛根素的内部交叉验证均方差是 RMSEP=0.137 1，决定系数 R2=0.984 5, 经对外部验正集样品进行外部验证，葛根素预测值与真值的相关系数是 r2=0.996 4，预测值 的平均回收率为 101.9%(RSD=1.189 %,n=5)。方法精密度 RSD 为 1.98% （n=20），方法稳定 性 RSD 1.57%（n=5）。结论：该方法是一种简便、快速、低耗的新型分析技术，可用于 为心通口服液的快速定性定量分析。

[关键词]：声光可调滤光器；近红外光谱技术；心通口服液； 主成分分析；偏最小二乘；葛根素；快速分析

    心通口服液为临床用于治疗冠心病、心绞痛的常用中成药,在 2005 版《中国药典》中心 通口服液分别以葛根素、丹参素钠和黄芪甲苷为对照品采用薄层色谱法定性分析，以葛根素 为指标成分，用 HPLC 进行定量分析[1]，被分析样品需要分别进行化学预处理，操作烦琐， 完成一个样品定性定量分析需要 6-8h。近红外光谱分析技术是一种现代高新分析测试技术， 国外应用该技术在西药成分检测与质量控制方面已相对比较成熟，美国食品药物管理局（FDA）、欧洲和加拿大药物局正式采用近红外光谱分析技术取代烦琐费时的分析方法，国内 在近红外光谱分析领域也取得了重要进展，2005 版《中国药典》也将“近红外分光光度法 指导原则”列入目录。近年来，近红外光谱分析技术以其独特的优点开始应用于中药分析[2–5], 研究工作者多采用傅立叶变换近红外光谱仪。AOTF-近红外光谱分析仪它采用了航天技术中 的“声光可调滤光器”（AOTF）作为分光元件，这种新型的近红外光谱仪具有结构简单、体 积小、重现性好和仪器环境适应性强的特点，试验分析既可在实验室内进行，也可用于现场 即时分析，现已开始应用于烟草及化工行业[6]，本研究采用 AOTF-NIR 光谱分析技术和化学 计量学方法，建立了心通口服液定性、定量分析数学模型，采集一次光谱数据即可完成定性、 定量分析，整个操作过程可在 3-5min 内完成，为心通口服液的快速分析提供了一种新方法， 同时为实现心通口服液的在线质量监控奠定了基础。

1    仪器与试药

1.1 仪器

美国 BRIMROSE 公司生产的 Luminar 5030 型便携式 AOTF 技术近红外光谱仪，主要部件 有：光学部分、控制部分、笔记本电脑等。仪器波长范围为 1 100 nm~2 300 nm，波长增量 2 nm，扫描次数为 300，采用 InGaAs 检测器。挪威 CAMO 公司 The Unscrambler 分析软件。Waters1525 色谱仪（美国 Waters 公司），Waters 2996 二极管阵列检测器，Empower 色谱工 作站。

1.2 试药

葛根素对照品（中国药品生物制品检定所,批号 110766-200417 供含量测定用）；甲醇、丙酮为色谱纯试剂；水为超纯水。 心通口服液样品（山东鲁南厚普制药有限公司提供）；双黄连口服液、银黄口服液、小儿清热止咳口服液、安神补脑液、藿香正气口服液、清开灵口服液、小儿肺热咳喘口服液、 健儿消食口服液、鼻窦炎口服液、脑心舒口服液等（购自济南药业集团有限责任公司等）。

2   方法与结果

2.1    样品准备

2.1.1 校正集与验证集样品 在定性分析中，选择山东鲁南厚普制药有限公司提供的 52 个 不同批号心通口服液，40 个样品组成校正集，12 个样品组成验证集。在定量分析中，为消 除建摸样品的含量范围和分布对所建校正模型性能的影响,本研究中除山东鲁南厚普制药有 限公司提供的不同批号心通口服液样品以外,还摸拟车间生产条件在实验室制备部分样品以 拉大含量分布范围，共收集样品 57 批,将 57 批样品分为校正集和验证集,其中验证集 5 批均 来自山东鲁南厚普制药有限公司。

2.1.2     口服液对照品   分别由双黄连口服液（Shl01- Shl10）、银黄口服液（yh01- yh05）、 小儿清热止咳口服液（qyzk01- qyzk02）、安神补脑液（asbn）、藿香正气口服液（hxzq）、 清开灵口服液（qkl）、小儿肺热咳喘口服液（fykc）、健儿消食口服液（jexs）、鼻窦炎口服 液（bdy）和脑心舒口服液（nxs）等 10 个品种组成。

2.2 近红外光谱采集及光谱预处理

使用美国 Brimrose 公司 Luminar 5030 型近红外光谱仪，通过安装的液体测量专用光纤 探头采集样品的光谱数据。准备 18×180mm 的试管，清洗干净凉干备用。将 Luminar 5030 近红外光谱仪通电开启，用专用的网线连接仪器与笔记本电脑，预热时间为 0.5h。

将液体测量专用探头安装到仪器的手持部分，探头的光程为 10mm，测量方式为透反射 测试。测量时，将口服液样品小瓶的密封口打开，倒入一备用的试管中，将光纤探头插入试 管中的液体，液体要将光纤探头的缺口部分完全覆盖，轻微晃动探头，将缺口部分可能存在 的气泡消除，稳定以后，开始扫描光谱。扫描完成，将探头取出，用吸水纸擦拭干净残留液 体后，进行下一个样品的扫描。每一张光谱都是 100 次扫描的平均结果，波长范围从 1 100 nm 到 2 300nm，波长增量为 2nm。每个样品重复扫描 3 次，得到原始光谱。

在建立模型前，首先对扫描得到的原始吸收光谱进行光谱预处理，以消除噪音和基线漂 移的影响。我们采用的预处理方法为一阶导数 9 点平滑法（savitzky-golay），经一阶导数 处理可以很好地消除样品由于颜色差别引起的光谱基线偏移和漂移。11 种口服液的原始光谱与一阶微分光谱见图 1.

图 1   口服液近红外原始光谱图和一阶导数光谱图

A、B－心通口服液     C、D－双黄连口服液     E、F－银黄口服液       G、H－其它 8 种口服液

2.3 建立心通口服液定性分析模型

在 52 个心通口服液样品中，随机取出 40 个样品组成校正集（名称为 xt-c），用于建立 心通口服液 XT-C 定性分析模型，其余 12 个样品作为验证集（名称为 xt-v），用来验证所建 立 模型 的 预测能 力 。 将 校正 集 样品 光谱 经 过 一 阶 微 分处 理 后 的光谱 数据 导入 The Unscrambler 分析软件，然后利用 PCA（主成分分析）对光谱数据进行计算，建立心通口服 液 XT-C 定性分析模型，40-个校正集样品的 PC1、PC2 主成分空间分布图见图 2。

图 2.    校正集心通口服液的 PC1、PC2 主成分空间分布图

2.3.1 检测模型效果

2.3.1.1      模型预测方法   对以 PCA 主成分分析法建立的心通口服液 XT-C 定性分析模型性能 的预测，可采用以下两种方法：一是通过计算机 Excel 表格显示的方法，二是模型区域判别 法，见图 3。在图 3 左侧表格中，如果在 Excel 表中样品编号后面是空白，说明该样品被检 测为不属于 XT-C 模型内样品，如果样品编号后面有*号标记，说明该样品被检测为属于 XT-C 模型内的样品；图 3 右侧是当 cignificance =5%时校正集样品形成的 XT-C 模型分布区域图， 如果被检测的样品 x 落在 XT-C 定性分析区域内，说明被检测的样品属于心通口服液，反之， 说明被检测的样品与建模样品不相同。

2.3.1.2      定性分析模型预测已知心通口服液样品（xt-v 验证集）  调用 40 个校正集心通口服液样品所建立的定性分析模型 XT-C，对 12 个验证集样品进行预测，得到的结果见图 3。 图 3 右侧图中在表格中所有 12 个验证集样品编号后面均有*号标记，说明他们属于模型内样 品，在模型区域图中，12 个验证集样品均落在 XT-C 模型区域内，说明被检测的样品与建模 样品相同，被 XT-C 定性分析模型认可，两种方法都说明被检测的样品属于建模样品，即是 心通口服液。

图 3         XT-C 模型预测验证集样品结果

2.3.1.3      定性分析模型预测口服液对照品   调用 XT-C 定性分析模型，分别对双黄连等 10 种口服液对照品进行预测，得到的结果见图 4-6。由图 4-6 可见，口服液对照品在 Excel 表 格中的样品编号后都没有*号标记，说明他们不属于模型内样品，在模型区域图中，口服液 对照品均没有落在 XT-C 模型区域内，以上两种方法均说明被检测的样品与建模样品不相同， 被 XT-C 定性分析模型排除，即不是心通口服液。

图 4     XT-C 模型预测银黄口服液样品结果              图 5   XT-C 模型预测双黄连口服液样品结果

图 6   XT-C 模型预测其他口服液样品结果

2.4 建立心通口服液定量分析模型

2.4.1 HPLC 分析 将上述 57 个样品按 2005 版《中国药典》心通口服液项下含量测定方法 测定样品中葛根素含量，每份样品重复测定 3 次，相对偏差小于 1.5%，以 3 次含量测定结 果的平均值为样品中葛根素的含量。

2.4.2 建立 PLS1 数学模型 将经过预处理后的光谱数据与 PHLC 分析数据进行关联，采用 偏最小二乘法（PLS1），交叉－验证法（cross-validation），用 The Unscrambler 定量分析 软件建立定量分析模型。NIR 和 HPLC 测定的异常值分别采用光谱影响值 Leverage 和化学值 误差 Residual 这两个统计量来检验剔除。经过异常值的剔除进行优化，得到了较为理想的 校正模型见图 7。葛根素模型的主成分维数为 5，该模型的决定系数 R2=0.984 5, 内部交叉 验证均方差 RMSEP=0.137 1。

图 7     葛根素预测值与真值之间的相关图

2.4.3 检测模型效果 以 PLS1 建立的葛根素定量分析模型对 5 份外部验正集样品进行分 析,得到样品葛根素的 NIR 光谱预测值与 HPLC 分析值之间相关性良好,葛根素 NIR 光谱预测 值与 HPLC 测定真值的相关系数 r2=0.9956.

2.4.4 精密度实验 取 1 个预测样品,重复扫描 20 次,将所得光谱带入建立的葛根素定量分 析模型计算含量,以考察方法的精密度,结果葛根素含量的 RSD 值为 1.98%，说明仪器精密度 良好。

2.4.5 稳定性实验 取 1 个预测样品，每 1h 扫描一次，于 5h 内重复扫描 5 次，考察样品的稳定性,结果葛根素的 RSD 值为 1.193%，说明样品在 5 小时内相对稳定。

2.4.6 预测回收率实验 取 5 个预测样品,分别扫描, 将所得光谱带入建立的葛根素定量 分析模型中,计算葛根素预测值与 HPLC 测定的真值之间的比值(预测回收率), 葛根素的平 均预测回收率为 101.9%,RSD 为 1.189%，结果见表 1。

表 1 葛根素预测回收率结果（n=5）

Tab 1    predicted recovery test of puerarin

3   讨 论

3.1 心通口服液是由山东鲁南厚普制药有限公司独家生产，由不同批号心通口服液建立的 XT-C 定性分析模型，可对样品心通口服液进行准确的判定。同时，对银黄口服液等 10 种口 服液对照品也能够准确地预测为不属于心通口服液。因此，该模型可用于心通口服液的快速 定性分析；用 57 个样品建立的葛根素定量分析摸型，经外部验正集样品验证，葛根素预测 值与真值的测定结果趋于一致，方法的精密度、稳定性和预测回收率良好，可满足药物分析 的要求。

3.2 采用 Luminar 5030 便携式近红外光谱仪对心通口服液样品直接进行扫描测定，只需对 待分析样品采集一次光谱数据，分别调用定性、定量分析摸型，经计算机处理在 3-5 分钟内 即可完成定性、定量分析，由计算机直接读取分析结果，不用化学预处理、速度快，效率高。

3.3   鉴于 AOTF 近红外光谱仪环境适应性强的特点，检测过程既可在实验室进行，也可用于其他场所的现场快速分析，因此，以 AOTF 近红外光谱技术建立的心通口服液快速分析方法， 不仅可用于心通口服液在药品流通领域中的快速质量评价，而且为建立心通口服液生产过程 中的在线质量鉴控奠定了基础。