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什么是SPIM或LSFM？
选择性平面照明显微术(SPIM)是一种快速温和的成像技术，结合了宽视野成像的速度、适度的光学切片和低光漂白。它已经成为一种重要的荧光成像方式，尤其是体积成像。SPIM也被称为光片荧光显微镜(LSFM)或简称为“光片”。1
SPIM或LSFM的定义特征是从侧面对焦平面进行平面照明。在任何给定的时间，只有样品的薄部分被照射，使光损伤最小化，并且还提供光学切片，与宽视场落射荧光相比，光学切片提高了SNR。因为图像是以宽视场(2D平行)方式采集的，光幕成像比一次只检测一个像素的点扫描共焦显微镜快得多。
“不同显微镜照明模式的比较(LSFM:光片荧光显微镜，WF:宽视野显微镜，CF:共焦显微镜). “经过JKrieger在CC BY-SA 3.0下使用，维基共享，6月7日泰国(Thailand), 2013.
由于三个关键特征，光幕显微术在体积成像方面迅速获得了普及:首先，由于激发被限制在焦平面附近，光损伤被最小化，例如生物存活更长时间。第二，获得良好的光学切片，通常接近共焦显微镜。第三，采集速度非常快，比传统的共焦显微镜快几个数量级。
SPIM的主要缺点是需要额外的光学元件来产生光幕。最常见的是，将单独的照明物镜放置成与检测物镜正交，并且将薄片生成光学器件放置在该照明物镜和激光源之间。增加额外的透镜会给成像系统和样品安装带来空间限制。本质上，显微镜需要围绕样品进行设计，因此有各种各样的光片显微镜设计，每种设计都最适合不同的样品和不同的安装要求。相比之下，传统的共焦或落射荧光显微镜只有一条光路，可以容纳更多种类的样品。换句话说，SPIM的优势是以任何单一工具更狭窄的适用性为代价的；这导致了不同光片显微镜配置的激增，每种配置都有自己的优缺点。
1有些人保留术语“SPIM”来表示由柱面透镜产生的静态光幕，而不是扫描光束来产生光幕。包括ASI在内的其他公司将SPIM等同于LSFM，部分原因是可以轻松地改变光幕发生器的类型，同时保持相同的显微镜配置。
ASI能帮上什么忙？
十多年来，应用科学仪器公司(ASI)一直采用模块化方法来构建显微镜，自2010年代初以来，我们增加了专门针对光片显微镜的组件。ASI的模块化组件可以很容易地组合成一个完整的SPIM显微镜，包括电动和压电台，光学机械，以及用于创建和移动光幕的扫描仪。需要物镜、激光器、滤光器和照相机来完成该系统；用户可以自己从相应的制造商那里购买这些其他项目，使用转售ASI硬件的各种系统集成商的服务，或者通过ASI购买。
ASI提供多种标准配置的薄片显微镜，包括iSPIM、diSPIM、oSPIM和ct-dSPIM。此外，使用ASI的组件极大地简化了定制/DIY光幕系统的构建。
也许实现光片显微镜最困难的方面是同步各种组件，包括样品移动、照相机、激光器和移动光束以产生光片。这些亚毫秒计时事件由ASI的控制器根据先前通过串行命令发送的设置进行处理。此外，意大利航天局还贡献了一个免费的开源微管理器插件，使配置相关的控制器设置和获取SPIM数据集变得容易。
生成光幕
产生一片光有两种主要方法。柱面透镜或类似元件可用于将光聚焦在一个轴(板厚度)上，同时使光在另一个轴(板宽度)上传播，从而一次性照亮整个视场。这通常被称为“静态”表。另一种方法是在成像相机的每次曝光过程中，使用检流计镜扫描穿过视场的光束，有时称为“数字”或“扫描”片。每种方法都有优点和缺点。静态片及时分散激发剂量，可以减少光损伤，并且产生起来不太复杂。然而，由于光源的来源是高斯光束，照明强度在整个区域内通常不是恒定的。数字片在容易改变的宽度上是均匀的，具有“停止运动”效果，这有利于移动样品，并且可以与相机的滚动快门结合用于1D共焦。由于sCMOS相机读数，静态片通常可以获得更高的帧速率。但是滚动快门可以允许在多视图方案中同时创建多个光幕。
理想的光幕应该非常薄，其强度完全限制在检测物镜的焦平面上，并且足够长以覆盖成像光学器件的整个视场。但是物理学介入了。聚焦的光线会发散，所以薄片越薄，薄的区域就越短。薄板相对较薄的距离称为共焦长度，通常与薄板厚度成平方比例。实际上，共焦长度通常与样品或视场的大小相匹配。
大多数情况下，板材具有近似高斯的轮廓，因为激光源源自高斯光束。对于静态片的情况，该高斯轮廓在聚焦方向上，数学上与扫描高斯光束相同。高斯光束/片的厚度和共焦长度可以解析地推导为:
腰部厚度= k1 *λ/nail 1
共焦长度= k2 *λ/(nail 1)2
其中k1和k2是无量纲常数，取决于厚度和共焦长度的选定定义，λ是真空波长，NAill是照明光束的数值孔径。对于常见定义，k1=k2=0.64。照明NA可以不大于照明光学器件的NA，但通常只是它的一小部分，从而如前所述，共焦长度足够大。
非高斯光束已经被用来产生包括贝塞尔光束、艾里光束和贝塞尔光束阵列的光幕。贝塞尔光束和艾里光束具有理想的无衍射或自愈的特性，这减少了阴影。相对于共焦距离，贝塞尔光束比高斯光束细得多，但是在中心薄瓣之外包括大量的激发光，增加了光损伤。可以使用贝塞尔光束阵列，其中阵列间距通过相消干涉(一种“点阵”)使离焦光最小化，这可以具有极好的效率，但是需要非常复杂的薄片生成光学器件，并且对样品散射和像差非常敏感。在更简单的方案中，干涉也可以用来减小薄板厚度。对于这种非高斯光束，共焦长度和厚度之间的基本折衷仍然存在，只是比例因子不同。
样本中的不透明区域会阻挡光幕，导致条纹假象，即照明光永远无法到达的阴影。这可以通过使用与成像平面共轭的检流计旋转光幕来减轻，并且被称为抗条纹。
为了收集3D或体积信息，要么需要将光幕移动通过样品，要么需要将样品移动通过光幕以产生一叠图像。可以使用检流计镜来移动光幕，并且检测物镜的焦平面需要前后移动(通常使用压电台)。或者，可以使用电动或压电载物台将样品移动通过空间静止的光幕。虽然叠置期间的采集速度主要受照相机速度和样品亮度的限制，但是压电载物台对于快速体积成像是优选的，因为它们可以比电动载物台更快地飞回到初始位置。电动载物台是大型和/或扁平样品的首选。
光学分辨率
如前所述，贝塞尔光束和晶格可以实现非常薄的光幕，代价是额外的复杂性。贝塞尔光束和类似的光束受到大量离焦光的影响，但对于多光子和样品来说是有用的，在这些情况下克服阴影伪影比过度光损伤更重要。晶格对样品引起的像差非常敏感，但对小样品可能有用。
横向(XY)分辨率与宽视野显微镜相同，与检测NA成反比。横向分辨率通常比轴向分辨率好得多，与其他显微镜方法相同。
轴向(Z)分辨率更复杂。基线轴向分辨率是检测物镜的景深，它与检测NA的平方成反比。然而，如果光幕比景深薄，则轴向分辨率可以提高。有效轴向分辨率是激发和检测PSF的卷积(照明PSF实际上由于片发散而略有变化，但可以近似为束腰)。
如果探测数值孔径较低(例如0.2)，景深会很大，通常可以产生足够薄的光幕来提高轴向分辨率。然而，即使如此，与横向分辨率相比，轴向分辨率通常仍然很差。
对于高NA检测物镜(例如NA 0.5及以上)，景深为几个微米，并且很难在实际的大视场上产生比这更薄的片。在这种情况下，光幕比景深稍厚，因此轴向分辨率与宽视场成像相同，光学切片是有帮助的，但并不完美。因此，所得数据的去卷积可以通过将离焦光重新分配给光源来提高图像质量。
如果采集到较小的视场并“平铺”在样品上，那么可以使用较薄的片来提高轴向分辨率。然而，这增加了光子剂量并可能增加了采集时间。从概念上讲，随着视场变小，这些“平铺”或“轴向扫描”方案变得越来越共焦，与具有大视场的SPIM相比，导致低光子效率和增加的光漂白。
如果样本是从不同的有利位置成像的，那么这些单独的3D数据集可以被组合成具有提高的分辨率的单个3D数据集。例如，在diSPIM中，采集同一样本的两个正交视图，每个视图具有良好的横向分辨率和较差的轴向分辨率。然而，每个轴向方向对应于另一视图中的横向方向。在配准和联合反卷积之后，可以产生具有各向同性“横向”分辨率的单个数据集。相同的方法通常应用于在来自不同视图的图像集合之间旋转的样本。数据后处理通常比采集需要更多的时间和精力，但只需要在已知良好的数据集上进行(通过查看各向异性的单个叠加)。此外，多个视图之间的配准要求样本在它们之间显著相同，即样本不能显著移动或变形。
配置
ASI提供多种模块化显微镜元件，可轻松实现薄片显微镜，包括:
- 电动和压电载物台
- 静态或扫描纸张的光幕发生器
- 用于远程聚焦和平移束腰的可调透镜
- 所有相关的控制电子设备，包括这些元件与摄像机和激光器的协调
- 光学机械，例如滤光器支架、运动镜、镜筒
- 透明组织成像物镜
- 通常用于无限显微镜的其他模块包括硬件自动对焦、LED照明器、转盘和物镜转换器、自动和手动滤光滑块、自动和手动端口开关、滤光轮等。
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